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段鋼，孫長(zhǎng)平
(杰能科國(guó)際生物工程有限公司，無(wú)錫，214035)
摘要：生物質(zhì)作為可以再生的能源廣泛存在于自然界中。應(yīng)用酶水解技術(shù)處理生物質(zhì)所制造的燃料酒精可以部分替代石油，生物質(zhì)還可以被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成其他的化學(xué)產(chǎn)品及生物化學(xué)品。預(yù)處理過(guò)程和纖維素酶成本的降低，纖維素酶效率的提高是生產(chǎn)生物質(zhì)酒精及其他化學(xué)產(chǎn)品的關(guān)鍵。文中介紹了該轉(zhuǎn)化過(guò)程的關(guān)鍵技術(shù)及其發(fā)展進(jìn)程和最新進(jìn)展。
1介紹
木質(zhì)纖維素原料可以用來(lái)生產(chǎn)酒精，是一種能替代有限的石油資源的能源。淀粉類糧食作物生產(chǎn)的燃料酒精已經(jīng)替代部分汽油成為汽車的能源。然而與石油燃料相比較，生產(chǎn)成本相對(duì)較高。以玉米淀粉為基礎(chǔ)原料來(lái)生產(chǎn)酒精，由于受土地限制產(chǎn)量是不可能大幅度增加的。一種低成本酒精生產(chǎn)的潛在的原料，就是利用木質(zhì)纖維原料，如農(nóng)作物殘?jiān)⒉荨⑺槟酒⒛拘己蛣?dòng)物的固體排泄物等。由于生物精練廠替代了煉油廠，作為再生能源的碳水化合物的原料轉(zhuǎn)化成碳?xì)浠衔锟梢愿幸嬗谏鐣?huì)和環(huán)境保護(hù)。以生物質(zhì)為基礎(chǔ)的酒精生產(chǎn)，其轉(zhuǎn)化過(guò)程主要有2部分：木質(zhì)纖維生物質(zhì)中的纖維素被水解生成還原糖和用還原糖的發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)酒精。當(dāng)前由木質(zhì)纖維原料來(lái)生產(chǎn)酒精存在的主要問(wèn)題是水解過(guò)程中產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高。目前在這方面的研究已取得一些成果。首選的方法是對(duì)生物質(zhì)原料進(jìn)行熱的化學(xué)預(yù)處理和用酶水解，經(jīng)過(guò)預(yù)處理的原料成為可轉(zhuǎn)化成酒精的發(fā)酵糖。預(yù)處理的研究是集中在縮短微生物轉(zhuǎn)化的時(shí)間，減少纖維素酶的用量和提高酒精的產(chǎn)率等方面。纖維素酶的研究則集中在開(kāi)發(fā)高效、高熱穩(wěn)定性、與其他酶混合所產(chǎn)生的協(xié)同增效作用來(lái)滿足終端用戶的需要。對(duì)于能將生物質(zhì)糖轉(zhuǎn)化成酒精和其他生物產(chǎn)品的高活性的發(fā)酵微生物也正在被開(kāi)發(fā)利用。相信不久的將來(lái)，會(huì)出現(xiàn)生物質(zhì)酒精生產(chǎn)的投資和建工廠(圖1)。
木質(zhì)纖維原料的預(yù)處理可以除去木質(zhì)素和半纖維素，能夠明顯提高纖維素的水解水平；應(yīng)用適合的纖維素酶也能夠提高水解水平；邊糖化邊發(fā)酵的工藝能有效地減少對(duì)于纖維素酶活性有抑制作用的葡萄糖含量，這樣就能夠提高生產(chǎn)量和纖維素水解的速度。
生物質(zhì)的酶法水解由于具有低能耗、產(chǎn)品專一并符合政府的環(huán)保政策而成為將來(lái)發(fā)展的主要手段。目前的纖維素酶由于其活性和穩(wěn)定性水平使得其制造成本過(guò)高而阻礙著對(duì)生物質(zhì)的水解應(yīng)用。開(kāi)發(fā)高效活性并穩(wěn)定的纖維素酶成為酶制劑研究領(lǐng)域的必然。
木質(zhì)纖維性物質(zhì)含有纖維素(38%～50%)，半纖維素(23%～32%)，多酚性木質(zhì)素(15%～25%)以及其他的可以提取的成分。
2木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)酒精的工藝技術(shù)
雖然有大量的原料可以利用，但是在工業(yè)上將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的最大挑戰(zhàn)是降低操作成本。主要是預(yù)處理過(guò)程和酶制劑的成本，以及新的更有效的酵母。
2.1木質(zhì)纖維原料的預(yù)處理
預(yù)處理的目的是去除木質(zhì)素和半纖維素，減少纖維素的結(jié)晶度和增加原料的多孔性。成功的預(yù)處理必須滿足以下需要：
?產(chǎn)生大量可被酶分解的多糖(如：打開(kāi)纖維素的結(jié)構(gòu)，使酶可以進(jìn)行作用)；
?低固定資產(chǎn)投入(壓力，建筑材料)；
?低能量消耗；
?從纖維素分解的C6糖的含量高；
?從半纖維素分解的C5糖的含量高；
?木質(zhì)素分解反應(yīng)程度低(對(duì)用于能量及化學(xué)原料，越完整越好)；
?所使用的化學(xué)品：費(fèi)用低/或者可回收；
?工藝放大容易納入整個(gè)系統(tǒng)。
大多數(shù)的預(yù)處理并不能完全水解木質(zhì)纖維原料生物質(zhì)中的所有纖維素。預(yù)處理能通過(guò)去除纖維素微纖維結(jié)構(gòu)周圍的半纖維素并連同木質(zhì)素的改變使纖維素的酶水解更加有效。物理法、物理2化學(xué)法、化學(xué)法和生物法等工藝已經(jīng)被用于木質(zhì)纖維原料的預(yù)處理。普通的預(yù)處理過(guò)程由于生物質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)而比較困難。所處理木質(zhì)纖維原料的成分取決于生物質(zhì)的來(lái)源和所處理的類型，但是，在通常情況下，使用纖維素酶和相關(guān)的酶對(duì)于天然生物質(zhì)的水解更有效。下面將簡(jiǎn)單介紹幾種預(yù)處理工藝。
(1)物理預(yù)處理：包括機(jī)械粉碎、高溫、冷凍/解凍循環(huán)和輻射，其目的是降低生物質(zhì)顆粒的大小和機(jī)械晶格。這些方法操作費(fèi)用一般昂貴。
(2)生物預(yù)處理：能夠使生物質(zhì)中的纖維素和木質(zhì)素發(fā)生降解，但不是很有效，而且需要比較長(zhǎng)的處理時(shí)間。
(3)化學(xué)法預(yù)處理：使用稀酸(最初利用硫酸)和蒸汽或者加壓的熱水可以水解出生物質(zhì)中大量的半纖維素，從中得到的可溶性糖就能夠達(dá)到比較高的產(chǎn)量。熱洗滌過(guò)程，使用不同的稀酸進(jìn)行預(yù)處理，包括所處理生物質(zhì)固體的高溫洗滌和分離，可以防止在預(yù)處理?xiàng)l件下所溶解的木質(zhì)素和木聚糖的再析出。木質(zhì)素的再析出會(huì)引起后續(xù)處理固體的酶水解的負(fù)反應(yīng)。最近已經(jīng)研究出在不嚴(yán)格的條件下的稀酸水解，并可以使含量較高的木聚糖轉(zhuǎn)化成為木糖，這一轉(zhuǎn)化過(guò)程必須要經(jīng)濟(jì)有效，因?yàn)樵谠S多木質(zhì)纖維原料中的木聚糖含量占全部的碳水化合物的1/3以上。另一方面，一些堿也能被用來(lái)預(yù)處理木質(zhì)纖維原料，處理效果取決于原料中木質(zhì)素的含量。堿預(yù)處理通常對(duì)于在可溶性多聚體中去除大量的半纖維素的同時(shí)，溶解大量的木質(zhì)素更加有效。堿水解的機(jī)理被認(rèn)為是由于分子間的酯鍵皂化交聯(lián)形成木聚糖，由于交聯(lián)鍵的斷裂，木質(zhì)纖維原料多孔性的增加，經(jīng)過(guò)稀堿NaOH處理后會(huì)引起原料的膨脹，從而導(dǎo)致內(nèi)表面積的增加，聚合度和結(jié)晶度的降低，木質(zhì)素和碳水化合物之間結(jié)構(gòu)鍵分開(kāi)，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)被破壞。氨冷凍噴爆(AFEX)分解纖維素并能減少纖維素酶的用量，同時(shí)還能去除半纖維素和木質(zhì)素。采用CO2汽爆對(duì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理的效果也很好。
(4)氧化去除木質(zhì)素木質(zhì)素能被過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶所氧化而降解。用H2O2預(yù)處理會(huì)大大提高酶水解的靈敏性。在30℃，2%H2O2下處理8h，大約有50%的木質(zhì)素和大部分的半纖維素被溶解，并且在隨后的糖化中，在45℃，24h之內(nèi)，被纖維素酶作用的纖維素可以產(chǎn)生95%的葡萄糖。
(5)有機(jī)溶解過(guò)程：在有機(jī)溶解處理過(guò)程中，一種有機(jī)或水合有機(jī)溶劑混合物與無(wú)機(jī)酸(硫酸或鹽酸)催化劑一起被用來(lái)分解原料內(nèi)部的木質(zhì)素和半纖維素的連接鍵。有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、丙酮、乙烯乙二醇、丙烯乙二醇以及四水合糠醛乙醇。有機(jī)酸如草酸、乙酰基水楊酸和水楊酸也能被用做有機(jī)溶解過(guò)程中的催化劑。高溫時(shí)(溫度超過(guò)185℃)，對(duì)于正常的去除木質(zhì)素作用的過(guò)程中不必加入催化劑，加入酸能夠得到較高的木糖產(chǎn)量。為了降低生產(chǎn)成本和保護(hù)環(huán)境，必須將在預(yù)處理過(guò)程中所使用的溶劑加以回收利用，另外將溶劑從生產(chǎn)系統(tǒng)中去除也是必需的，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑可能會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，影響酶水解和發(fā)酵。
(6)微生物預(yù)處理：在微生物的預(yù)處理過(guò)程中，一些微生物例如褐色、白色和溫和的腐敗真菌可以被用來(lái)降解廢物原料中的木質(zhì)素和半纖維素。白色腐敗真菌對(duì)于木質(zhì)纖維原料的微生物預(yù)處理效果最好，許多白色腐敗真菌產(chǎn)生的細(xì)胞外酶能夠降解木材細(xì)胞壁。其他的酶包括多酚氧化酶、漆酶、過(guò)氧化氫生成酶和苯醌還原酶也能降解木質(zhì)素。微生物預(yù)處理的優(yōu)點(diǎn)有低能耗和溫和的作用條件。然而，大多數(shù)的微生物預(yù)處理過(guò)程中的水解速度很慢。
所有的預(yù)處理工藝都會(huì)受到密集投資的制約。例如，對(duì)于水解過(guò)程所需要的昂貴的反應(yīng)器材料以及由于在預(yù)處理過(guò)程中所使用的催化劑而生產(chǎn)的廢物的處理和回收的成本。一些預(yù)處理工藝，像AFEX，由于廢物產(chǎn)生得較少，優(yōu)勢(shì)比較明顯，這樣，在預(yù)處理中可以實(shí)現(xiàn)比較高的纖維素的消化利用，高的半纖維素糖的回收，較低的資金投入和低的木質(zhì)素分解以及降低生產(chǎn)過(guò)程中化學(xué)品的回收利用成本。
2.2酶水解
纖維素的酶水解是由具有高效性的纖維素酶來(lái)完成的。水解產(chǎn)物通常是包含葡萄糖在內(nèi)的還原糖。同酸或者堿相比較，酶水解的成本是比較低的，因?yàn)槊竿ǔＪ窃诒容^溫和的條件下(pH值4.8，溫度45～50℃)完成，而且不會(huì)有腐蝕問(wèn)題。細(xì)菌和真菌能產(chǎn)生使木質(zhì)纖維原料水解的纖維素酶。微生物可以是需氧或厭氧的、嗜熱或嗜溫的。纖維素酶通常是幾種酶的混合物，在水解過(guò)程中包括至少3種主要的纖維素酶：
(1)內(nèi)β-葡聚糖酶(EG內(nèi)切21，42D2葡聚糖苷水解酶，或EC3.3.1.4)，主要用在纖維素中低結(jié)晶度的區(qū)域，隨機(jī)產(chǎn)生短鏈分子；
(2)外β-葡聚糖酶或纖維二糖酶(CBH1，42β2D2葡聚糖，纖維二糖水解酶，或EC3.2.1.91)，進(jìn)一步從隨機(jī)的短碳鏈中降解分子以去除纖維二糖。
(3)β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)可水解纖維二糖成葡萄糖。
除了這3種主要的纖維素酶以外，還有很多的輔酶能夠作用于半纖維素。如葡糖苷酸酶、乙酰酶、木聚糖酶、β2木聚糖酶、半乳甘露聚糖酶和葡甘露聚糖酶等。在酶水解期間，纖維素被纖維素酶降解成為能被酵母或細(xì)菌發(fā)酵成酒精的還原糖。
用纖維素酶水解生物質(zhì)中的纖維素生產(chǎn)酒精有著巨大的潛力。雖然對(duì)于纖維素酶的開(kāi)發(fā)已經(jīng)過(guò)了數(shù)十年，但這些酶的成本還是很高。目前需要降低生產(chǎn)纖維素酶的成本才能使木質(zhì)纖維生物質(zhì)生產(chǎn)酒精的工藝更具有競(jìng)爭(zhēng)性。纖維素酶是作用相對(duì)緩慢的酶，實(shí)質(zhì)上是由于它們所作用底物的復(fù)雜的，不可溶解的，和半晶體的結(jié)構(gòu)。除此以外，還需要纖維素酶有比較高的活力以及相關(guān)的內(nèi)β-葡聚糖酶，外β-葡聚糖酶和β2葡萄糖苷酶的協(xié)同作用才能將纖維素完全轉(zhuǎn)化成葡萄糖。
用纖維素酶生產(chǎn)生物酒精，在酶的開(kāi)發(fā)方面，不僅要提高酶的穩(wěn)定性，而且還要在預(yù)處理工藝的苛刻的條件下提高酶的有效的活性。其次，不同的生物質(zhì)，其預(yù)處理工藝都是不一樣的，結(jié)果也會(huì)使產(chǎn)物含有不同的成分。因此，纖維素酶能夠分解的是預(yù)處理后的適合于酶作用的組分。例如，由于底物表面的β-1，4糖苷鍵的高通透性可以提高內(nèi)、外-β-葡聚糖酶作用的效率，同時(shí)外-β-葡聚糖酶與內(nèi)-β-葡聚糖酶的比率較高適合于作用具有較低聚合度的底物分子。高含量的木質(zhì)素阻礙酶的滲透，吸附酶使之不能作用，引起最終產(chǎn)物的抑制并降低纖維素的轉(zhuǎn)化率。除了纖維素的晶格和聚合度的范圍以外，半纖維素的脫乙酰作用和水解也影響酶的需求。
高含量的木質(zhì)素能夠阻礙酶的滲透，吸附酶使之不能作用，引起最終產(chǎn)物的抑制并降低纖維素的轉(zhuǎn)化率。除了木質(zhì)素以外，纖維二糖和葡萄糖也是比較強(qiáng)的纖維素酶抑制劑，纖維素酶的活性能夠被它們所抑制，現(xiàn)在已經(jīng)研究出幾種方法來(lái)降低抑制作用，包括使用高濃度的酶制劑；在水解期間β-葡萄糖苷酶的補(bǔ)加；用超濾技術(shù)去除葡萄糖或者同時(shí)進(jìn)行糖化和發(fā)酵(SSF)等方式。
SSF工藝已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于規(guī)模生產(chǎn)。為了減小水解最終產(chǎn)物的抑制作用，在這個(gè)工藝過(guò)程中，纖維素在糖化水解中產(chǎn)生的還原糖被立即發(fā)酵成酒精，這樣可以大大降低水解產(chǎn)物葡萄糖的抑制作用。
與兩段式間歇的水解和發(fā)酵工藝相比較，SSF具有以下優(yōu)點(diǎn)：由于對(duì)纖維素酶活性有抑制作用的葡萄糖被轉(zhuǎn)化，從而可以提高水解的效率；比較少量的酶需求；比較高的產(chǎn)品產(chǎn)量；由于葡萄糖可以被立即去除并有乙醇產(chǎn)生，因此對(duì)于操作條件的要求比較低；比較短的生產(chǎn)時(shí)間；由于水解和發(fā)酵可以在一個(gè)反應(yīng)器內(nèi)同時(shí)進(jìn)行，因此可以有比較小的反應(yīng)器體積。但是，在SSF工藝中產(chǎn)生的乙醇也能抑制纖維素酶的活性。曾經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證明，在SSF工藝的反應(yīng)期間，在38℃下，當(dāng)乙醇的濃度分別達(dá)到9、35和60g/L時(shí)，纖維素酶的活力會(huì)損失到它的初始酶活力的9%、36%和64%。SSF工藝的缺點(diǎn)有：水解和發(fā)酵溫度的矛盾；微生物對(duì)于乙醇濃度的耐受性；纖維素酶的活性被乙醇所抑制。
3纖維素酶的最新進(jìn)展
目前對(duì)于發(fā)展酒精生產(chǎn)用纖維素酶的研究主要集中在以下幾方面：
?發(fā)現(xiàn)和克隆從自然界來(lái)源的酶；
?通過(guò)分子演化和設(shè)計(jì)來(lái)提高酶的功能性；
?通過(guò)強(qiáng)化的低成本發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)酶制劑。
運(yùn)用科學(xué)的研究方法，例如從已知的不同種類的纖維素酶的基因進(jìn)行表達(dá)和純化；發(fā)現(xiàn)新酶的活性，通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程識(shí)別新的纖維素酶蛋白質(zhì)；在先進(jìn)的工藝條件下通過(guò)蛋白質(zhì)工程和直接的轉(zhuǎn)化來(lái)提高纖維素酶的性能，使酶獲得改進(jìn)；并尋找使最大量的生物質(zhì)混合物降解的最優(yōu)化方案。這些研究成果最終導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)了幾種新型的糖基水解酶。而且，以前很多的未知的里氏木霉(T.reesei)蛋白質(zhì)的基因密碼也被發(fā)現(xiàn)，例如：葡聚糖酶，殼多糖酶，蛋白酶等等。
杰能科國(guó)際生物公司與美國(guó)能源部開(kāi)展合作，研制開(kāi)發(fā)從木質(zhì)纖維原料中轉(zhuǎn)化酒精的生物技術(shù)，已經(jīng)取得了突破性的成就。從2000年起，杰能科國(guó)際生物公司與美國(guó)能源部下屬的美國(guó)國(guó)家再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)合作，雙方共投資2000萬(wàn)美元，開(kāi)發(fā)低成本的纖維素酶和其他的酶，用來(lái)轉(zhuǎn)化生物質(zhì)生產(chǎn)酒精和其他產(chǎn)品。在NREL模式下，3年內(nèi)的目標(biāo)是將纖維素酶的成本降低1/10倍。這一目標(biāo)已在在以下2個(gè)方面取得了重大的進(jìn)步：①纖維素酶生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性(每克酶減少的成本)和②纖維素酶的性能(所需纖維素酶減少的克數(shù))。2003年，由于研究開(kāi)發(fā)了一套生產(chǎn)強(qiáng)效的纖維素復(fù)合酶系統(tǒng)的工藝，酶的成本降低20倍的目標(biāo)，而且還超過(guò)了此目標(biāo)。最近，酶的成本又進(jìn)一步降低至原來(lái)的30倍，因此酶制劑的成本問(wèn)題已經(jīng)不再是工業(yè)化的主要阻礙。當(dāng)然值得指出的是，這個(gè)酶成本的降低是以美國(guó)能源部所提供的預(yù)處理底物為基準(zhǔn)的，對(duì)其他底物的處理效果可能會(huì)不同。
4生物質(zhì)生產(chǎn)酒精前景展望
利用木質(zhì)纖維生物質(zhì)生產(chǎn)燃料酒精可以改善能源保障，實(shí)現(xiàn)能源供應(yīng)的可持續(xù)發(fā)展，同時(shí)拉動(dòng)農(nóng)業(yè)及其他相關(guān)行業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。盡管生物質(zhì)酒精的生產(chǎn)通過(guò)技術(shù)改進(jìn)已經(jīng)有了很大的發(fā)展，但仍面臨著許多挑戰(zhàn)：
——開(kāi)發(fā)性價(jià)比更好的纖維素酶；
——在商業(yè)范疇內(nèi)，開(kāi)發(fā)基因工程酵母；
——研究更高效的預(yù)處理技術(shù)；
——摸索整個(gè)乙醇生產(chǎn)系統(tǒng)中最優(yōu)的經(jīng)濟(jì)成分配置。
除了前面提到的酶制劑成本及有效性外，工業(yè)化面臨的另一個(gè)難題是，在預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的5C糖并不能被目前在工業(yè)上廣泛應(yīng)用的Saccharomyces酵母所利用。美國(guó)能源部與杜邦化學(xué)、美國(guó)玉米種植協(xié)會(huì)合作以期找到可有效利用木糖、戊糖和阿拉伯糖的菌種，該計(jì)劃預(yù)計(jì)在2007年之前完成。
更有效和環(huán)保的預(yù)處理過(guò)程和過(guò)程的優(yōu)化對(duì)工業(yè)化業(yè)有非常大的影響。當(dāng)然，如前面提到的，系統(tǒng)過(guò)程的放大，工程的設(shè)計(jì)優(yōu)化還需要時(shí)間。然而隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，能源危機(jī)的加重，相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，以酶解技術(shù)處理生物質(zhì)將被應(yīng)用于工業(yè)化酒精和其他生物產(chǎn)品的生產(chǎn)上。 |
